克隆形成实验方法原理与步骤解析

2022-10-20 10:36:33

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　　克隆形成实验是测定细胞增殖能力的有效方法之一，贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。通过观察单细胞集落形成情况，来计算克隆形成率，了解其增殖能力。

　　其技术原理：单个细胞在体外持续增殖6代以上时细胞数量已达60个左右，此细胞群体成为克隆或集落，大小在1.0-2.0 mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力，各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖率和对生存环境的适应性。软琼脂培养或平板克隆是最常用的方法。

　　平板克隆形成（Colony Formation）：细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞。

　　实验步骤

　　Step1：细胞培养，调整细胞状态

　　Step2：制备单细胞悬液

　　Step3：按不同的细胞浓度梯度把细胞均匀接种于培养平板

　　Step4：培养一段时间

　　Step5：观察克隆情况，固定染色后计算克隆形成率

　　软琼脂克隆形成（Soft Agar Colony Formation）：利用软琼脂为培养介质，使细胞在悬浮状态下生长。

　　实验步骤

　　克隆形成实验需要注意的几个点：

　　1、对数生长期，细胞状态良好的情况下，0.25%胰酶消化，离心后重悬时一定要吹打成单细胞悬液。可以选择6孔板作为克隆培养板，按密度梯度（如100、200、300）接种进孔板中。接种后切记晃动平板，使细胞分布均匀。

　　2、培养2周左右（出现肉眼可见细胞集落时），即可固定染色。加固定液和染色液时，覆盖住孔板底层即可。但如果长时间不处理，需增加液体量，防止液体干涸，影响拍照效果。