一、无菌

　　无菌的操作要**细胞培养中的头等大事，从培养基到操作过程再到培养箱，不管哪一环节忽视了无菌的原则，细胞的损失必将惨重，甚至有可能全军覆没。

　　1.超净台

　　超净台可以看做是一个微型的无菌室，做好维护工作，就能提供一个不错的无菌环境。在使用之前和之后，用70%-75%酒精棉，反复擦洗台面。如果超净台处于人流较大的环境。在开启超净台之前可在周围喷70%-75%酒精。除此之外，也可用紫外灯**：经常用的超净台开15分钟便可，不经常使用的超净台开半小时。

　　2、酒精灯

　　酒精灯的高温灼烧可以消灭大多数的微生物，在操作过程中，玻璃制具（如移液管，玻璃管、10 ml移液枪头等）都要注意在酒精灯上灼烧十多秒，等待冷却再使用。而对于塑料一类的材料（如瓶塞等），也要在酒精灯前面过一下。

　　3、试剂

　　细胞培养中所用到一切试剂（如培养液、生长因子、抗性试剂、筛选的**等），都有遭受微生物污染的可能性，而试剂染菌是很大一部分染菌现象的根源。因而，使用试剂前好验菌，哪怕是**产品，用前也要验菌，用完还需拿封口膜将其封口。另外，试剂在冰箱放久了，再次使用前也要验菌。在这些小细节上多花一些时间，便可换来我们的安心。

　　4、个人卫生

　　实验者的个人卫生情况对细胞培养成功与否也有很大的关系，比如隔离服、手套、口罩等清洁装备，可以防止自带的污染菌接触细胞。东西要进入超净台，可以用酒精棉擦拭以**。记住，要避免未经****的东西与细胞相接触！

　　二、培养条件的品质

　　上等的硬件设施、培养试剂和实验耗材很大程度上可以细胞培养的顺利进行，实验室如果有条件的话，所有的东西都尽量使用好的，比如：

　　1.硬件设施：好的超净台和生物安全柜等。

　　2.培养试剂：培养基、血清、胰酶、生长因子、抗性试剂、筛选的**等尽量使用进口产品；

　　3.实验耗材：培养皿、移液枪、枪头等也尽量使用进口产品。

　　三、操作习惯

　　1.自己准备一套个人的实验器具，不要和别人混用。

　　2.不管是买的细胞、还是惠赠的细胞，刚拿到手赶紧的做两件事：

　　①　检测是否有支原体污染；

　　②　迅速扩增冻存。

　　3.发现细胞有污染的迹象就迅速处理掉：**污染和**污染很容易发现，而支原体污染后，细胞会长的慢，买个支原体检测的kit定期检测一下。

　　4.别怕浪费，像枪头之类的实验耗材，只要有可能污染就立即更换。

　　5.近换了什么新的东西稍微记一下，试剂一旦怀疑污染，马上丢。

　　6.实验时所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已**物品要分开放置。

　　7.动作要快，胰酶消化，换液等，细胞暴露在空气中的时间越少越好。

　　8.吹的时候，动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来。吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的头部尽量深的在液面以下。

　　9.对于娇弱的细胞，要更细心呵护：胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间，每天都要去看一下细胞——肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。

　　10.离开过操作台的东西再进操作台之前要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。

　　11.使用酒精灯时，别直接放到火上，离一段距离。

　　12.身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方，比如实验台和培养箱内部等。

　　13.实验结束后对实验台的**、和细胞房日常的值日清洁是的，此外还要定期熏蒸。

　　14.培养箱隔一段时间用酒精棉擦洗一次。

　　四．细胞传代、冻存和复苏

　　细胞传代是细胞培养比较重要的一环，传代的好坏会影响细胞的生长状态（传代时机、传代时间长短、传代手法）；而细胞冻存和复苏重要的就是慢冻速融。

　　1.一般细胞汇合度达到70%就可以进行传代。如果想要细胞状态更好，可以在汇合度50%左右就进行传代。当然接种的时候也相应的减少数量，保持细胞生长周期在三天以上（传代太频繁，细胞状态很差）。

　　2.传代时细胞数量不可以太稀，传的稀的细胞会长的特别慢；细胞密度也不能太大，到时候培养基营养不够，出现凋亡细胞。

　　3.细胞的传代要规律，保持相同的频率和传代时间间隔，不要随心所欲或者拖延。

　　4.有时间的话，需要细胞计数：传相应数目的细胞到培养皿中，可以大致清楚细胞的生长曲线，不会临时要处理，手足无措。

　　5.不同细胞生长周期不同：有的生长很快（比如MDA-MB-231），传代时取离心悬液的十分之一就已经足够了；有的生长很慢（比如BT474），传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满，所以要在培养细胞的过程中多多摸索。

　　6.细胞冻存前**习惯换液：通常是细胞传代两天后换液，然后第三天冻存细胞，主要是让细胞保持对数生长状态。

　　7.冻存液：冻存液好现用现配。

　　8.冻存盒：冻存盒用完好放在室温中。很多同学用完冻存盒后，直接将其放到-80℃，下次冻存细胞接着用。这时候冻存盒本身已经接近-80℃，里面的异丙醇已经不能起到缓慢降温的作用了。

　　9.冻存细胞复苏后**天好更换一次培养基。

　　10.每次开展相关实验的时候（**筛选等），铺板和冻存一起做，就是铺板的细胞同时冻存一批，如果实验结果不错，后期可以马上复苏出来重复实验。

　　五、其他注意事项

　　1.培养基的配制要做好梯度摸索并详细记录，否则细胞都不知道是怎么死的。

　　2.细胞房不能进去太多人，避免相互干扰。

　　3.尽量提高操作熟练度，减少培养皿在培养箱外的滞留时间，细胞很脆弱，经不起折腾。

　　4.把握好培养基更换的时间，不同细胞类型时间不同，早了浪费试剂，晚了可能全军覆没。

　　5.要做什么心里要非常清楚，合理安排时间，细胞房的实验穿**行，可以节省很多时间，也不会耽误别人的实验。

　　6.养细胞大的教训：不能偷懒！