一、免疫组织化学技术的基本原理

　　应用免疫学和组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位定性、定位或定量研究，称为免疫组织化学或免疫细胞化学。

　　众所周知，抗体与抗原的结合具有高度的特异性。免疫组织化学就是利用这一特性，即先提取组织或细胞中的一些化学物质，然后作为抗原或半抗原免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体。然后将此抗体(第一抗体)作为抗原免疫动物制备第二抗体，用某种酶(常用的辣根过氧化物酶)或生物素处理，再与前述抗原成分结合，扩增抗原。由于抗体与抗原结合形成的免疫复合物是无色的，所以需要借助组织化学方法显示抗原与抗体的反应部位(常见的显色剂DAB显示为棕黄色颗粒)。

　　通过抗原抗体反应和显色反应，可以显示细胞或组织内的化学成分，在显微镜下可以清楚地看到细胞内抗原抗体反应的产物，从而可以原位确定某些化学成分在细胞或组织内的分布和含量。或者组织中任何可以作为抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸、病原体等，都可以通过相应的特异性抗体进行检测。

　　二、免疫组织化学染色法

　　1.根据标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等。可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标记法和免疫金银法等。

　　2.按染色步骤可分为直接法(也称一步法)和间接法(二步法、三步法或多步法)；与直接法相比，间接法的灵敏度要高得多。

　　3.根据结合方法可分为抗原抗体结合法，如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法和亲和连接法，如卵清蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法和链霉菌亲和素-过氧化物酶连接(SP)法，其中SP法是最常用的方法。

　　三、几种常用免疫组织化学方法的原理

　　1.免疫荧光法

　　这是最早建立的免疫组织化学技术。基于抗原抗体特异性结合的原理，将已知的抗体用荧光素标记，作为探针检查细胞或组织中相应的抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受到激发光照射时，会发出一定波长的荧光，从而可以确定抗原在组织中的位置，进而进行定量分析。免疫荧光技术因其特异性强、灵敏度高、快速简便而广泛应用于临床病理诊断和检验。

　　2.免疫酶标记法

　　免疫标记是20世纪60年代继免疫荧光之后发展起来的一项技术。基本原理是先将酶标记的抗体与组织或细胞反应，再加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒。通过光学显微镜或电子显微镜，定位细胞表面和细胞内部的各种抗原成分。免疫标记技术是目前最常用的技术。

　　和免疫荧光技术相比，该方法具有以下优点:定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适用于光镜和电镜研究。

　　随着酶标记方法的快速发展，衍生出了多种标记方法。随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度也在不断提高，使用也越来越方便。目前病理诊断中广泛应用的有PAP法、ABC法和SP法。

　　3.免疫胶体金技术

　　胶体金技术使用胶体金，一种特殊的金属颗粒，作为标记。金胶体是指金的水溶胶，能快速稳定地吸附蛋白质，但对蛋白质的生物活性无明显影响。因此，利用胶体金标记的一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白(如葡萄球菌蛋白A)的分子作为探针，可以对组织或细胞中的抗原进行定性、局部甚至定量的研究。由于胶体金具有大小不一的颗粒，且胶体金的电子密度高，因此免疫胶体金技术特别适用于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。胶体金本身是浅到暗红色的，所以也适合光学显微镜观察。比如应用银增强免疫金银法则，用光学显微镜观察更方便。

　　四、免疫组织化学技术的优势

　　1.特异性强。免疫学的基本原理决定了抗原和抗体的结合具有高度的特异性。所以从理论上讲，免疫组化也是抗原在组织细胞中的特异性展示，比如角蛋白展示上皮成分，LCA展示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会发生交叉反应。

　　2.高灵敏度在免疫组化应用的初期，由于技术的限制，只有直接法和间接法等低灵敏度的技术。这时候抗体只能稀释几倍或者几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，稀释几千、几万甚至几亿倍的抗体仍能在组织细胞中与抗原结合。这种高度敏感的抗体-抗原反应使得免疫组织化学方法越来越方便地应用于常规病理诊断。

　　3.定位准确，形态与功能相结合。该技术可以通过抗原抗体反应和显色反应在组织和细胞中准确定位抗原，使不同的抗原在同一组织或细胞中同时定位和观察，从而研究形态和功能的结合，对病理学的进一步研究具有重要意义。