MTT实验步骤及注意事项

2023-03-14 10:38:43

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　　MTT全称为3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，汉语化学名为 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT法，又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

　　MTT细胞实验步骤

　　1、细胞种板：将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为1-10×104个/ml的细胞悬液，按10000细胞／孔接种于96孔板，每孔加100μl，置于CO2（5％）培养箱中37℃下培养24h以贴壁。

　　2、加药处理：继续培养0h、12h、24h、36h分别更换为100μl细胞样品各自对应的含有浓度药物的培养基，对照组更换为含溶剂的培养基，分别记为药物处理48h、36h、24h、12h。每个样本浓度设三个重复。

　　3、MTT反应：所有孔中加入20μl 浓度为5mg/ml的、新鲜配制的MTT溶液，培养箱中孵育4小时，使MTT还原为甲瓒（此时倒置显微镜下可看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体）。

　　4、DMSO溶解甲瓒：小心的吸除上清液，每孔加DMSO（二甲基亚砜）150μl，用摇床摇匀。

　　5、测吸光度值：使用酶标仪测定570nm光吸收值，以溶剂处理细胞为对照组，按公式计算药物对细胞的抑制率。

　　抑制率＝1－（实验组-空孔）/（对照组-空孔）

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