眼睛是人体重要的感觉器官。据统计，2019年全球共有7.1亿人患有各种形式的眼病，我国眼病患者约1.9亿（占比27%），居世界之首。眼病不仅给患者带来不同程度的视觉损伤或丧失，导致生活和工作不便，还会加重家庭和社会的负担。那么关于眼病有什么课题设计思路呢？

下面，我们将结合一篇发表于中科院1区期刊Science Translational Medicine，影响因子为17.1的高分文献来具体讲解眼病相关的课题设计思路，文献名为《肠道许可的β7⁺ CD4⁺ T细胞导致青光眼视网膜神经节细胞进行性损伤》，希望能给大家带来不一样的灵感。

【文章题目】：肠道许可的β7⁺ CD4⁺ T细胞导致青光眼视网膜神经节细胞进行性损伤

【发表期刊】：Science Translational Medicine

【影响因子】：IF=17.1

【发表日期】：2023.08

一、研究背景

①降低眼压（EIOP）触发的自身免疫成分参与了青光眼的继发性神经变性。

②T细胞在进行性青光眼神经损伤的发病机制中发挥重要作用。

③肠道内容物提取物可以交叉激活CD4⁺ T细胞与视网膜特异性T细胞受体，但是潜在机制尚不清楚。

④肠道屏障损伤可导致小鼠视网膜内层神经元损伤，并且表达肠归巢分子β⁷的CD4⁺ T细胞在其中扮演了至关重要的病理损伤角色。

二、技术路线

三、研究结果

1.青光眼患者归巢CD4⁺ T细胞百分比与视力损害相关

CD4⁺ T细胞能表达一组表面分子，在其上印记肠道归巢特异性，可以迁移到肠道。β7整合素是记录最充分的肠道归巢标志物。我们可以从图1A看到，为了研究肠道归巢CD4⁺ T细胞在青光眼中的作用，作者收集了临床血液样本进行流式细胞术，以确定表达β7的群体在CD4⁺ T细胞总数中的百分比。图1B研究结果发现，青光眼组中β7⁺ CD4⁺ T细胞的百分比增加。

如图1B~C所示，作者根据H-P-A分期系统，将患者分为早期、中度和重度三组，然后又根据高级青光眼干预研究评分系统（AGIS），将患者分为早期、中度、重度和终末期四组，最终发现在两种分期系统中，β7⁺ CD4⁺ T细胞的百分比随着疾病严重程度的增加而增加。另外，从图1E~F可以看出，作者还根据C/D占比或视网膜神经纤维层（RNFL）厚度分层将患者分组，结果表明β7⁺ CD4⁺ T细胞的百分比随着C/D的增加和RNFL变薄而增加。

2.进行性青光眼RGC损伤与小鼠循环β7⁺ CD4⁺ T细胞增加有关

然后，作者在小鼠的双眼前房注射了微珠悬浮液，诱导青光眼模型。图2A显示，该模型表现出约28天的EIOP期和延长的RGC变性。图2B和2C则显示，使用Brn3a免疫荧光染色对视网膜平板支架中的RGC损失进行量化。此外，我们可以从2D实验结果发现，注射微珠后30~60天，RGC损失逐渐恶化；从图2E则可以发现进行性青光眼小鼠的循环β7⁺ CD4⁺ T细胞明显增加。

接下来，作者将进行性青光眼小鼠分为两组：β7⁺ CD4⁺ T细胞≥10.6%的β7^hi小鼠；β7⁺ CD4⁺ T细胞＜10.6%的β7^mid小鼠。如图2F所示，在所有三个时间点，β7^hi组小鼠的RGC损失均高于β7^mid组小鼠。

3.青光眼中β7⁺ CD4⁺ T细胞促进RGC进行性丢失

为了研究循环中的β7⁺ CD4⁺ T细胞是否可以迁移到视网膜中，如图3A所示，作者使用流式细胞术检测对照组和青光眼小鼠的视网膜组织。图3B结果显示，对照组和急性青光眼小鼠（30天前）视网膜中β7⁺ CD4⁺ T细胞的百分比较低，而进行性青光眼小鼠的视网膜中β7⁺ CD4⁺ T细胞的百分比较高。接着，我们可以从图3C进行性青光眼小鼠的RGC层中发现β7⁺细胞。此外，在图3D~F中，为了证实β7+ CD4+ T细胞在青光眼中的致病作用，作者在注射微珠后25~60天内静脉注射抗α4β7抗体；且阻断α4β7减少了青光眼RGC丢失。这些结果表明，阻断β7⁺ CD4⁺ T细胞向视网膜的募集可以改善视网膜的神经炎症，防止RGC丢失。

4.MAdCAM-1的异位视网膜表达是进行性RGC损伤所必需的

作者团队在结肠炎诱导的视网膜神经变性模型中证实了MAdCAM-1介导的β7⁺ T细胞募集进入视网膜，其他实验室也证实了MAdCAM-1对中枢神经系统炎症的作用。如图S5所示，作者首先在青光眼小鼠中观察到CD4⁺ T细胞与视网膜内皮细胞表达的MAdCAM-1共定位。图4A~C结果显示，青光眼小鼠中表达MAdCAM-1的视网膜血管数量更多；视网膜内脉管系统由位于不同视网膜深度的3个相互连接的平行血管丛层组成，支持不同层视网膜神经元的代谢需求。另外，我们还可以从图4D~E的结果观察到，在青光眼小鼠视网膜的3个神经丛层中，表达MAdCAM-1的血管数量都有所增加，但MAdCAM-1在与RGC层共定位的浅层中最高。

图4F~G结果显示，在注射微珠后第25~60天，通过玻璃体注射抗体阻断视网膜MAdCAM-1，能减少青光眼小鼠的RGC损失。另外从图4H、图S10A~B结果可以发现，与EIOP诱导的WT小鼠相比，注射微珠60天后，MAdCAM-1−/−小鼠的RGC损失和T细胞浸润显著降低。这些数据表明MAdCAM-1和β7⁺ CD4⁺ T细胞在视网膜中的相互作用对青光眼RGC损伤至关重要。

5.在小鼠中β7⁺ CD4⁺ T细胞经过重编程获得青光眼致病性

接着，我们可以从图5A~C看到，作者先发现了在EIOP诱导的小鼠外周血中循环β7⁺ CD4⁺ T细胞先于视网膜积累。然后，作者针对第10天和第30天的小鼠纯化的β7⁺ CD4⁺ T细胞进行了RNA测序。图6A~B结果显示，β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞比β7⁺ CD4⁺ _10d T细胞的基因表达谱发生了更多的变化。具体从图6C~D可以看到，β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞中富集的生物过程（bp）包括细菌应答、白细胞迁移、粘膜免疫和炎症反应。这表明CD4⁺ T细胞需要来自肠道微生物群的激活信号才有资格诱导青光眼变性，而由粘膜炎症引发的β7⁺ CD4⁺ T细胞具有侵入视网膜的能力。此外，图6E~F显示，β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞上调了一些参与神经胶质活性和神经元死亡的基因。这说明它们可能与视网膜胶质细胞和神经元相互作用。这些结果表明，EIOP诱导的β7⁺ CD4⁺ T细胞在注射微珠后的第10天至第30天对其基因表达谱进行了重编程，这可能催化了β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞的青光眼致病性。

6.β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞诱导MAdCAM-1在视网膜血管中的表达，促进其进入视网膜

根据RNA-seq结果，作者开始进一步验证β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞是否可以介导青光眼RGC损伤，如图7A所示，作者从青光眼小鼠中分离出β7⁺ CD4⁺ _30d或β7⁺ CD4⁺ _10dT细胞，用CFSE标记后，经尾静脉转移至WT受体小鼠。图7B~C结果显示，重建4天后，在β7⁺ CD4⁺ _30dT细胞受体的视网膜中可以观察到明显的血管外CFSE标记细胞，并且侵入性β7⁺ CD4⁺ _30dT细胞优先浸润RGC所在的浅层。这表明β7⁺ CD4⁺ _30dT细胞确实具有青光眼的致病性。

此外，可以从图7D观察到在β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞受体的视网膜微血管上表达MAdCAM-1。并且与小鼠视网膜微血管内皮细胞共培养的β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞，如图7E~G所示，在体外同样诱导MAdCAM-1表达。这些数据表明，EIOP诱导的β7⁺ CD4⁺ T细胞经历了功能性重编程，并变得有能力穿越血视网膜屏障，至少一部分是通过MAdCAM-1在视网膜微血管中的诱导。

7.β7⁺ CD4⁺ T细胞归巢到肠道环境是它们进入视网膜的重要过程

造模后，作者发现β7⁺ CD4⁺ T细胞在肠道内的占比在第10天增加，早于视网膜，如图8A~B所示，这表明EIOP诱导的β7⁺ CD4⁺ T细胞可能在到达视网膜之前走上“肠道弯路”。为了进一步验证，作者在图8C中对β7⁺ CD4⁺_10d T细胞进行了继代转移实验，并在转移后第4天检测到CFSE标记细胞在肠道中浸润，但此时视网膜中没有明显的CFSE信号；图8D~F结果显示，重建14天后，CFSE标记细胞从肠道中消失，到达视网膜。

接着，我们从图8G~H观察到，从EIOP诱导的WT或MAdCAM-1−/−小鼠中分离出β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞，并将其转移到WT受体小鼠。图8H结果显示，来自MAdCAM-1−/−供体的β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞在移植后4天未能侵入受体视网膜，但来自WT供体的β7⁺ CD4⁺ _30d T细胞可以浸润RGC所在的浅层。这些数据表明，β7⁺ CD4⁺ T细胞归巢到肠道是它们进入视网膜的必要条件，并解释了为什么无菌肠道环境的小鼠对进行性青光眼RGC损伤具有抵抗力。

四、研究总结

作者通过研究发现在青光眼患者中，表达肠道归巢整合素β7的循环CD4⁺ T细胞的百分比增加，并与疾病分期相关。接着又在EIOP触发的青光眼小鼠模型中发现，β7⁺ CD4⁺ T细胞通过诱导视网膜内皮细胞中MAdCAM-1的表达，在青光眼的进展期浸润视网膜。由于MAdCAM-1在健康小鼠的视网膜中检测出最低限度，所以用MAdCAM-1抗体中和改善了青光眼小鼠RGC的丢失和胶质活性。接着作者又通过研究进一步发现，EIOP诱导的β7⁺ CD4⁺ T细胞在青光眼急性期归巢于肠道，这对患病小鼠的进行性RGC损伤至关重要。然后，作者将肠道归巢的β7⁺ CD4⁺ T细胞进行了转录重编程，并显示出在自身免疫性疾病、细菌反应、黏膜免疫和胶质细胞活性中富集的上调通路。然后通过引导β7⁺ CD4⁺ T细胞获得了诱导视网膜MAdCAM-1表达和跨越血-视网膜屏障的能力。最终该研究揭示了经肠道许可的β7⁺ CD4⁺ T细胞和MAdCAM-1的作用，并强调了“肠-视网膜”轴在青光眼中的重要性。

五、相关国自然中标项目