卵巢衰老的秘密，你知道么？女性在40岁以前出现卵巢功能减退的现象，被称为卵巢早衰（POF）。那么关于卵巢早衰有什么课题设计思路呢？

今天我们将分享一篇发表于中科院1区期刊Nature Aging，影响因子为17的高分文献，名为《人卵巢衰老的时空转录组学变化及FOXP1的调控作用》，这篇文章是将生信分析与实验验证相结合，希望能给大家带来不一样的灵感。

【文章题目】：人卵巢衰老的时空转录组学变化及FOXP1的调控作用

【发表期刊】：Nature Aging

【影响因子】：IF=17

【发表日期】：2024.04

一、研究背景

①人类卵巢由不同阶段的卵泡作为基本功能单位和大量的间质细胞组成。

②近年来使用scRNA-seq技术的研究表明，人类卵巢中存在丰富的细胞类型，如粒细胞（GCs）、卵母细胞、基质细胞和免疫细胞。

③人类卵巢在皮层和髓质上表现出广泛的变异，卵子发生的过程始于皮层，而卵巢的髓质区域经历了戏剧性的重组。

④空间转录组学（ST）是一项新技术，它使用大量条形码oligo-dT引物捕获细胞切片中的信使RNA，然后将转录物映射到组织切片上，从而实现基因表达的空间可视化。

二、技术路线

三、研究结果

1.人卵巢细胞的scRNA-seq分析和空间定位

作者首先从青年、中年和老年志愿者中收集处于卵泡期的健康卵巢。生成了9个卵巢组织（来自9名参与者）的scRNA-seq数据和28个卵巢组织（来自15名参与者）的ST-seq数据。我们可以从图1b看到，作者使用均匀流形近似和投影（UMAP）算法进行非线性降维分析，并根据特定的细胞标记识别出8种细胞类型。图1c的GO分析发现，在GCs中高表达的基因在调节激素水平方面富集，而在卵母细胞中高表达的基因与卵母细胞分化有关。图1d的卵巢细胞分布空间图显示，可识别的细胞类型包括位于卵泡中心的卵母细胞（i）、卵泡周围的GCs（ii）、广泛分布的抑制性T细胞（T&S细胞）（iii）、血管周围的平滑肌成纤维细胞（SMC细胞）（iv）和内皮细胞（v）；还有单核细胞（vi）、NK细胞（vii）和T淋巴细胞（viii）等免疫细胞。

2.卵巢老化转录程序中细胞特异性的变化

接着，作者对青年、中年和老年年龄组中不同卵巢细胞类型的基因表达模式进行了比较分析。DEG分析强调了围绝经期卵巢与青年或中年阶段具有生殖功能的卵巢之间的显著差异。图2a的GO和KEGG富集分析显示，细胞衰老可能在人类卵巢衰老中起重要作用。图2b则显示，在衰老过程中，大多数卵巢细胞的衰老信号通路评分升高。而图2c的空间基因表达数据的通路分析进一步表明，衰老卵巢的卵泡、皮层和髓质中细胞衰老和衰老相关分泌表型（SASP）信号通路的富集增加。

我们还可以从图2d观察到，脂褐素在卵巢衰老过程中积累增加。图2e显示，主要的衰老标志CDKN1A/p21在大龄人群的所有卵巢细胞类型中表达增加。然后利用ST数据进行空间表达分析，如图2f~g所示，证实了CDKN1A在卵巢衰老过程中的总体增加，特别是在GCs和T&S细胞中。同时，图2h显示，年龄较大的卵巢中SASP的表达增加。总之，这些发现表明，老年人类卵巢中的特定细胞类型可能表现出与细胞衰老相关的独特特征。

3.卵巢衰老过程中卵母细胞的时空变化

紧接着，作者对卵母细胞的伪时间轨迹进行了分析，如图3a~b所示，确定了三个分期阶段（集群a、b和c）。图3c的伪时间分析显示，青年组的卵母细胞处于轨迹的开始，而老年组的卵母细胞处于终点状态，提示衰老过程中的GeneSwitch。图3d的聚类分析表明卵母细胞中的DNA损伤和凋亡值得被关注。接下来，作者又比较了DNA损伤和修复基因列表，并生成了卵母细胞衰老过程中的评分；如图3e所示，衰老的卵母细胞DNA损伤评分升高，DNA修复评分降低。我们还可以从图3f结果观察到，在老年组中，卵母细胞与其他类型细胞之间的相互作用显著增强。图3g~f显示，衰老的卵母细胞表现出受体-配体对MDK-LRP1的表达升高，说明该受体-配体对MDK-LRP1在慢性炎症和炎症细胞募集中起着至关重要的作用。

4.衰老过程中GCs的时空转录变化

GCs包裹发育中的卵母细胞并相互作用，但在衰老过程中的分类和变化并不清楚，为此，如图4a所示，作者通过UMAP分析将所有GC分为三种亚型（GC亚型1、2和3）。图4b的分析表明，年轻组的GC主要是GC亚型1和2，而老年组的GC主要是GC亚型3。图4d结果显示，GC亚型1位于窦卵泡积云内，亚型2位于囊壁层内，亚型3广泛分布于窦卵泡内。此外，我们可以从图4e看到，作者使用亚型特异性标记验证证实了这些不同的空间分布。图4f~h显示，早期GC亚型1主要分布在中青年卵巢中，而老年样本中的GC主要分布在GC亚型3的末端，表明在卵巢衰老过程中GC发生了GeneSwitch。这种成分的转变可能意味着功能性GC类型的减少和衰老卵巢中凋亡GC的潜在增加。

接着，作者还计算了细胞衰老评分，如图4i所示，揭示了衰老卵巢中所有三种类型的GC的增加。图4j的免疫染色分析证实，CDKN1A蛋白水平在老年卵巢GCs中升高。此外，我们可以从图4k~m结果观察到，老年组的GC表现出更高水平的细胞衰老和SASP评分，特别是在GC亚型1中。这些发现表明，细胞衰老是GCs衰老的一个潜在特征，这可能导致衰老过程中的卵巢功能障碍。

5.衰老过程中T&S细胞的时空变化

卵巢包含一个显著的间质间室，目前卵巢间质细胞的分类和与衰老相关的变化未知，如图5a所示，作者通过UMAP分析确定了5种具有不同转录组特征的T&S细胞亚型。在图5b~d中，亚型1表现出丰富的RNA和蛋白质合成过程，并在卵巢髓质中广泛分布；亚型2表达ECM基因，位于卵泡周围；亚型3表达肌成纤维细胞标记物，在血管周围的超分子纤维通路和细胞骨架蛋白结合中富集；亚型4可能参与卵巢对外部应激的防御；亚型5可能参与排卵后修复。这些发现表明存在五种不同的T&S细胞群，如图5e~g所示，它们的时空动态可能与它们的功能有关，在衰老过程中T&S细胞的类型可能发生变化。同样，衰老过程中，所有T&S细胞亚群的细胞衰老评分都有所增加，如图5h~l所示，CDKN1A表达上调，SASP因子显著升高。

6.FOXP1是体外卵巢细胞衰老的核心转录调控因子

接着，我们可以从图6a~e观察到，人类卵巢中FOXP1的表达在hGCs和pT&S中显示出与年龄相关的下降。图6f~j显示，沉默了COV434和pT&S细胞中的FOXP1，导致衰老相关（SA）-β-gal染色增加，与细胞衰老和DNA损伤相关的蛋白质上调，细胞增殖受损，衰老标志物和SASP升高，而细胞周期相关基因降低。图6k的ChIP证实FOXP1与CDKN1A启动子结合，提示FOXP1通过抑制CDKN1A转录抑制卵巢细胞衰老。图6l的双荧光素酶实验表明FOXP1的激活降低了野生型CDKN1A启动子活性，而CDKN1A启动子中FOXP1的突变则消除了这种作用。然后我们可以从图6m~p观察到，过表达FOXP1降低了SA-β-gal染色和CDKN1A的表达。这些结果表明FOXP1通过结合其启动子抑制CDKN1A转录，从而在防止卵巢细胞衰老中发挥作用。

7.GCs中FOXP1基因敲除加速卵巢衰老

为了研究FOXP1对卵巢衰老的影响，作者将FOXP1loxP/loxP小鼠与CYP19A1-Cre转基因小鼠杂交，如图7a所示，从小鼠GCs中去除FOXP1基因。图7b~d的体内实验证明，FOXP1tr/tr小鼠的健康卵泡数量减少，闭锁卵泡数量增加；图7e~h显示，血清AMH和雌二醇（E2）水平降低，产仔数减少，卵巢中细胞衰老相关基因mRNA水平显著升高，凋亡的GCs增加。这些发现表明，GCs中FOXP1的缺失加速了卵巢衰老，表现为卵泡储备减少和后代大小减小。

8.槲皮素保护中年小鼠卵巢储备

为了研究延缓卵巢衰老的可能性，如图8a~e所示，作者用槲皮素治疗育龄小鼠。我们可以从图8f~h观察到，处理1个月后，发情周期和血清AMH水平证实槲皮素对36周龄小鼠的卵巢储备的保护作用。图8i显示，36周大的槲皮素处理小鼠的成功怀孕比例也高于对照组。我们还可以从图8j~m观察到，槲皮素处理显著降低了卵巢中SA-β-gal活性，衰老标志物CDKN1A和γH2AX蛋白水平降低，FOXP1的表达也显著增加。总之，这些发现表明槲皮素可以改善中年小鼠的卵巢功能。

四、研究小结

本研究观察了衰老过程中八种卵巢细胞的时空分子特征。与年龄相关的基因表达变化分析表明，DNA损伤反应可能是卵母细胞衰老的一个关键生物学途径。此外，研究还发现了三种粒细胞亚型和五种透明带及基质细胞亚型，以及它们在衰老过程中的时空转录组学变化。FOXP1是卵巢衰老的调控因子，随着年龄的增长而下降，并抑制CDKN1A的转录。沉默FOXP1会导致小鼠卵巢早衰。这些发现全面证实了人类卵巢衰老的时空变异性，有助于确定潜在诊断生物标志物和治疗策略的优先次序。

五、国自然中标情况