实验原理及用途

　　原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。

　　用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

　　用具准备

　　180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

　　电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

　　处理DEPC水(2L)备用。

　　用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

　　制胶

　　称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)

　　在通风厨中加入3.6ml的10＊DenaturingGelbuffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。

　　将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。

　　胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1xMOPSGelRunningbuffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml1×MOPSGelRunningbuffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer），并检查点样孔。

　　RNA样品的制备

　　在RNA样品中加入3倍体积的formaldehydeloaddye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。

　　短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

　　电泳

　　将RNA样品小心加到点样孔中。

　　在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。

　　紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

　　探针的制备

　　在1.5ml离心管中配制以下反应液：模板DNA(25ng)、1ulRandomPrimer2ul灭菌水11ul总体积：14ul

　　95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。

　　在离心管中按下列顺序加入以下溶液：10×Buffer2.5ul、dNTPMixture2.5ul、111TBq/mmol[a-32P]dCTP5ul、Exo-freeKlenowFragment1ul

　　混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。

　　65°C加热5min使酶失活。

　　探针的纯化及比活性测定

　　准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。

　　取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填SephadexG-50凝胶。

　　将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加SephadexG-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处

　　100ulSTE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。

　　倒掉离心管中的溶液后，将去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了SephadexG-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。

　　将标记的DNA样品加入25ulSTE，取出0.5ul点样于DE8 paper上，其余上样于层析柱上。

　　1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper，测比活性。

　　预杂交

　　将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。

　　加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm²膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4h。

　　探针变性

　　90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。

　　短暂离心，将溶液收集到管底。

　　杂交

　　加入0.5mlULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。

　　42℃杂交过夜（14~24hr）。杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。

　　洗膜

　　低严紧性洗膜：加入LowStringencyWashSolution#1(100cm²膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。

　　高严紧性洗膜：加入HighStringencyWashSolution#2(100cm²膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃摇动洗膜20min两次。

　　曝光

　　将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。

　　检查膜上放射性强度，估计曝光时间

　　将X光底片覆盖与膜上，曝光

　　冲洗X光底片，扫描记录结果。

　　去除膜上的探针

　　将200ml0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。

　　注意事项

　　操作应该小心，但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡。