酶联免疫吸附试验基本原理

　　①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

　　②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

　　方法类型和操作步骤

　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：

　　①固相的抗原或抗体，

　　②酶标记的抗原或抗体，

　　③酶作用的底物。

　　根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

　　双抗体夹心法

　　包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。

　　洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

　　每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。

　　洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

　　加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。

　　洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

　　加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。

　　加终止剂：每凹孔加2M H2SO4 或2M 柠檬酸 0.05 ml。

　　观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。

　　双位点一步法

　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法测定中，应注意钩状效应，类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

　　间接法测抗体

　　包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20 ug/ml）各0.3 ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时，贮存冰箱。

　　洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

　　加被检标本：每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0. 2ml，37℃，作用1～2小时。

　　洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

　　加入酶结合物：每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2 ml 37℃作用1～2小时。

　　洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

　　加入0.2 ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。

　　加终止剂：每凹孔加2M H2SO4 或2M 柠檬酸 0.05 ml。

　　观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。

　　竞争法

　　包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。

　　洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

　　分2组，a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2 ml，b组只加酶标记抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度）

　　四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

　　加入0.2 ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。

　　加终止剂：每凹孔加2M H2SO4 或 2M 柠檬酸 0.05 ml。

　　用酶标比色计测定a、b两组OD值，并求出a、b、OD值的差数。

　　捕获法测IgM抗体

　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：

　　将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

　　加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

　　加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

　　加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

　　加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

　　应用亲和素和生物素的ELISA

　　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规 ELISA 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

　　ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中，通常标准配体是固定的，通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键。通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体，而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量。第二种抗体能识别抗体的末端，在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色。