凝胶阻滞（迁移）实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种研究蛋白与核算相互作用的技术。可用于验证转录因子与启动子相互作用的，也可用于蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用。今天我们就为大家介绍一下凝胶阻滞实验原理及步骤，跟着做，你也能一步一步完成凝胶阻滞实验。

　　实验原理

　　实验主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。

　　实验步骤

　　1.实验前准备

　　（1）合理的实验方案

　　根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。

　　（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。

　　（3）探针制备 根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。

　　2.形成蛋白-探针复合物

　　（1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：

　　（2）冰浴5min后，加入1μ探针。（对照组加1ul对照探针）

　　（3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。

　　3.制备凝胶电泳

　　（1）制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）

　　（2）按标准步骤制备凝胶。（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。

　　（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。  （5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）

　　4.转膜

　　（1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。

　　（2）按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。

　　（3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。

　　5.检测

　　（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥） （2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。 （3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上） （4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。 （5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡） （6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。