做过分子实验的人都知道，要想做的有效率有质量是很苦逼的，1 个月做 100 个克隆那都是 小 case，没点看家的本事怎么行。如果再遇到比较稀有的基因，周旋个把月，那也是家常便饭。下面就和大家分享一些载体构建的经验，从此迈向科研达人！

　　1. 准备工作

　　俗话说：用欲善其事，必先利其器。建议大家在做构建之前先找好工具，效果事半功倍哦。 推荐两个工具，一个是 oligo 软件，常用于引物设计和酶切位点分析；另一个是 DNAstar 软件，工具*大，一款全面的生物医学软件，用作 DNA 和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理。

　　2. 设计引物

　　1) 注重要：看懂质粒图谱！拿大家比较熟悉的 PEGFP-C1 和 PEGFP-N1 做例子。 想用 N1 质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来 结果根本不表达融合蛋白，你就死了；C1 质粒，注意阅读框，要是移码了，你也死了。而且 139PEGFP 系列有 1.2.3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！

　　其他需要注意：

　　*设计酶切位点时要加保护碱基（大家要用 T 载体就当我没说）;

　　*酶切位点设计原则：尽量用粘性末端，实在不行就用一些常用平端酶，如 EcoRV 和 SnaB1 等，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算 TM 值的时候要减去这些不匹配的序列；

　　*注意 KOZAK 序列的问题，很多质粒没有提供 KOZAK 序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。

　　*擅用 Gene Overlap，比方说加个 flag 标签，his 标签，my 标签之类的，直接设计三引物 overlap 一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。引物长一点不要紧（两步法），尤其是对 GC 比高的序列，有时候引物不长 PCR 根本不出结果，注意如果 GC 比较高，这个时候 Gene Overlap 就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。

　　*没有合适的酶切位点？很简单，用同尾酶策略，比方说 Bgl2 和 BamH1，Nhe1 和 spe1，Xho1 和 Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧。

　　3. PCR 扩增

　　如果没有现成的质粒可供酶切，PCR 是很理想也是很方便的策略。目前市面上可选择的 PCR 酶实在太多，每隔一段时间还会升级，正常情况下，高保真的 taq 酶都能满足需求。但如果遇到难 PCR 的高 GC 基因，可以换不同 PCR 酶，添加一些 DMSO，甘油等，实在不行可以考虑 Clontech 的 2 GC rich kit，价格和实力都大牛。另外，建议电泳切胶回收纯化 PCR 产物， 去除一些非特异性条带。

　　4. 酶切

　　强烈推荐 NEB 的内切酶，记得有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用 NEB 的酶，切个七十二小时仍旧一切 OK，尤其现在 NEB 还推出了 HF 的内切酶，没有星活性而且统一都用 Buffer4。另外 TAKARA 的酶也还可以。

　　5. 连接

　　常用的是 NEB 的 T4 连接酶，很好用，但是注意 Buffer 里有 ATP，反复冻融 ATP 失活很快， 拿到 buffer 后就分装，10uL/管，一次性使用。

　　载体总量：一般来说，载体浓度在 20-100ng/uL 较好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从 50-100ng 就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用 10-15uL。

　　载体和插入片段比例：载体和插入片段比例一般是 1:7，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高片段浓度，同时加大比例 1:10。

　　6. 转化

　　按照 SOP 做就行，话说实验室原来从 takara 买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高（protocol 免费索取）。要注意的是 LB 必须无菌而且没有抗生素。

　　7. 鉴定

　　想要快速鉴定，建议用菌液 PCR，菌液 PCR 是有一定讲究的，很多人做菌液 PCR 鉴定假阳性特多，为什么？因为你 PCR 引物选的都在载体上，注意引物必须分别在载体和插入片段上才准，PCR 方法鉴定是极其准确的，数百次菌液 PCR 经验。PCR 鉴定做起来也很简单， 拿个 2mL tube，装 0.5mL 加入相应抗生素的 LB，摇个三小时左后取 1uL 做模板就行了。如果想更快，直接菌落 PCR 也不错，效果一样。

　　8. 测序

　　拿到测序结果时，不仅要核对序列，还要看测序峰图，这很重要。因为有时候光看序列对，实际上图显示的不对，或者虽然序列结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子；还要重点检查的地方就是“接头"的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一两个碱基什么的，如果不仔细检查到了后期悔之无及。