一、什么是PCR？

PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称，是一种体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。经过演化和革新，PCR技术已经发展了三代:普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术(qPCR)以及数字PCR(dPCR)技术。

二、PCR的原理

PCR的基本原理与DNA的体内复制相类似，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火和延伸三个基本反应步骤构成。

三、PCR三个基本反应步骤

①模板DNA的变性:模板DNA经高温(95°C左右)加热一定时间后，使其解离成单链，以便它与引物结合。
②模板DNA与引物的退火(复性):将温度降至55°C左右时引物与模板DNA单链按碱基互补配对的原则结合。
③引物的延伸:再将温度调至72°C左右(DNA聚合酶最适反应温度)，DNA模板和引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下按碱基配对与半保留复制原理，沿着磷酸到五碳糖(5'→3')的方向合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这样经变性、退火和延伸重复若干个循环后，就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

四、如何区分PCR、qPCR、dPCR、RT-PCR、RT-qPCR

1．普通PCR

普通PCR即一代PCR，使用普通PCR扩增仪扩增靶基因并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。

2．实时荧光定量PCR（Ouantitative Real-time PCRqPCR）

实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。

qPCR常用的有两种方法：

①荧光染料法（SYBR Green l）

②荧光探针法（TaqMan）

3．数字PCR（Digital PCR，Dig-PCR，dPCR）

数字PCR即三代PCR，是对原始PCR的另一种改进，是一种能够实现核酸绝对定量的精准检测技术。基于泊松分布原理将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元（纳升级）中，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行扩增，从而实现靶标核酸分子的绝对计数，提高检测灵敏度和准确度。

基于分液方式的不同，数字 PCR 主要分为3种：
①微流体数字PCR（Microfluidic digital PCR，mdPCR）

②微滴数字PCRDroplet digital PCR，ddPCR)

③芯片数字PCR（Chip digital PCR，cdPCR）

4．逆转录PCR（Reverse T ranscription-PCR，RT-PCR）

逆转录PCR也叫反转录PCR，将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增相结合，也是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中首先经反转录酶将一条单链RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

RT-PCR技术灵敏且应用广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通过一步法或两步法进行，一步法是RT反应和PCR反应在同一试管中进行；而在两步法中两个反应是分开依次进行的。

5．实时荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR，RT-qPCR）

Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的”RT“是Reverse transcription（逆转录）的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。

与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有一步法和两步法两种方法。

五、不同PCR方法的主要优缺点

1. PCR

优点：成本低；标准完善；产物可回收用于实验。

缺点：操作繁琐；特异性和敏感性低；容易污染其他实验，只能定性不能定量。

2. qPCR

优点：特异性和灵敏度高；操作简便；可定量分析。

缺点：成本高；产物不可回收。

3. dPCR

优点：绝对定量；更高的敏感性和特异性。

缺点：成本昂贵；操作复杂；费时

4. RT-PCR和RT-qPCR

优点：可与所有的 RNA 类型一起使用。

缺点：RNA 容易降解；RT步骤可能会增加时间和污染的可能性。